Gramfärgning

Minsta antal poäng för att klara kursen: 70 %.

På och i vår kropp finns det mängder av bakterier. De flesta av dem är "goda," alltså bra för oss. De brukar kallas för normalflora. Men om en "god" bakterie hamnar på fel plats, då kan den göra oss sjuk. Ett exempel på detta är vår vanligaste tarmbakterie som heter Escherichia coli (E. coli). Den finns i vår mage och hjälper oss att vara friska, men det är också den vanligaste orsaken till urinvägsinfektioner. 

Ibland händer det också att vi får "onda" bakterier, och då blir vi också sjuka. Dessa bakterier kan behöva behandlas med antibiotika. Men för att läkaren ska kunna ge patienten rätt antibiotika måste du först ta reda på vad det är för bakterie som patienten har drabbats av. Läkaren tar ett prov från patienten, sedan får du provet och nu är det din tur att göra en gramfärgning. Gramfärgning är en av flera metoder som kan användas för att ta reda på viken typ av bakterier en patient drabbats av. 

Agarplattor och buljonger

Agarplattor och buljonger

Bakterier odlas oftast på agarplattor. En agarplatta är en petriskål i vilken man har hällt agar, glukos och andra ämnen den bakterie man vill odla behöver för att leva och föröka sig. 

Ibland kan man också tillsätta ämnen (exempelvis salt) som hindrar en viss typ av bakterier från att föröka sig. Det är smart, för då vet du att om det växer på plattan är det inte den bakterie som mår dåligt av exempelvis salt. En sådan agarplatta kallas för selektiv.

Väldigt ofta odlar man ut bakterier på en platta som heter blodagar till att börja med, i den finns det precis som det låter blod. Då är det hästblod. (Jo, hästar donerar blod). De flesta bakterier trivs på en blodagarplatta. Sedan kan man odla vidare på andra plattor, helt beroende på vad man misstänker att det är för bakterie; det finns plattor som kallas för cledagar, hematinagar, MH-agar och så vidare... 

Ibland odlar man bakterier i buljong. Då kallas det för att man har en bakteriesuspention; alltså bakterier i lösning. Då tar man ett mycket liten mängd bakterie, placerar dem i e-kolv med buljong och placerar e-kolven på en omrörare (så att buljongen hela tiden rörs om). Sedan lämnar man detta i 37 C över natten, och dagen därpå har man en illaluktande lösning med bakterier!

Isoleringsutstryk på agarplatta

Börja med en ren agarplatta

Börja med en ren agarplatta, där agarn är hel och jämn utan några märken. Bilden till höger föreställer en agarplatta ovanifrån. 

Primärutstryk

Ta en ren platinös, rör med den lite lätt vid en bakteriekoloni, och dra ett fstreck från kanten på agarplattan in mot mitten. Men inte enda in mot mitten. Nu har du ett första tjockt streck som kallas för primärutstryk fyllt med en massa bakterier på din agarplatta. Kom ihåg att agar är mjuk, det är lätt att ha sönder den så var mjuk på handen.  

Sekundärutstryk

Det andra strecket kallas sekundärutstryk. Ta en ny ren platinös. Dra den över strecket som du gjorde; från den ena sidan till den andra. Försök få det så tätt som möjligt, men bara i ett laget. Gå inte tillbaka för att fylla i mer. Nu har du smetat ut bakterierna som fanns i det tjocka strecket så att de hamnar på sidorna. Det blir färre bakterier på sidorna än vid det tjocka strecket. 

Tertiärutstryk

Det tredje strecket kallas för tertiärutstryk. Byt till en ny ren platinös. Dra ett streck över sidan som på bilden. Var noga med att dra strecken en enda gång. Sedan; när du fortsätter att dra platinösen fram och tillbaka över agarn gör du det utan att komma i kontakt med området där du redan varit med den förra platinösen. Nu har du smetat ut bakterierna ännu mer, i ännu lägre mängd. 

Kvartärutstryk

Det fjärde och sista utstryker kallas kvartärutstryk Byt till en ny ren platinös igen. Gör på samma sätt som alldeles nyss, börja att dra ett enda streck över området där du nyss drog platinösen. Fortsätt sedan att dra den fram och tillbaka på det sista området på agarplattan som är rent. Nu har du smetat ut bakterierna ännu mer. Om du gjort rätt kommer det vara mycket bakterier där du började, men bara enskilda kolonier där du slutade. 

Så här ser det ut på riktigt, när man drar en platinös över en agarplatta. 

Sedan stoppar man plattan i ett värmeskåp, i en temperatur på 37 grader cenlcius, och dagen därpå har bakterierna blivit fler. Faktiskt så många att de bildar kolonier som kallas för colony formin units (CFU). På bilden ovan är varje prick en CFU, och den består av miljontals bakterier. 

Vilken platta börjar man oftast att odla ut bakterier på?

  • Selektiv agarplatta
  • Blodagarplatta
  • Cledagar
  • Hematinagar

Gramfärgning

Stavar, kocker, spiriller

Till vänster ser du stavformade bakterier (stavar). I mitten ser du bakterier som kallas för kocker, och till höger bakterier som kallas för spiriller. Det är deras form som avgör om bakterierna är stavar, kocker eller spiriller. Det är bland annat bakteriernas form, som man kan se i ett vanligt ljusmikorskop, som gör att man kan se vilken bakterie det är. Men förutom formen måste man också titta på gramfärgningen.

Grampositiva och gramnegativa bakterier

Det var en man som hette Gram som kom på det där med gramfärgning. Han kom på att olika sorters bakterier är uppbyggda på olika sätt i sin cellvägg. Framför allt upptäckte han skillnader som gjorde att han kunde dela upp bakterierna i två grupper; grampositiva och gramnegativa bakterier. 

Både de grampositiva och gramnegativa bakterierna har några saker gemensamt: 

  • Peptidoglukan. (Bilden till vänster). Detta är ett nätverk av polysackaridkedjor (långa kedjor av hopsatta sockermolekyler). Det finns två typer av socker, det ena är N-acetylglukosamin (NAG) och  det andra N-acetylmuramisk syra (NAM). 
  • Peptider. Korta kedjor av amonisyror. Dessa som binder ihop peptidoglukanet. Nätverket gör att bakterien sitter ihop, att den håller. 


Bilden är en ritning av peptidoglukanets uppbyggnad. 

De saker som skiljer sig åt mellan bakterierna är... 

Grampositiva bakterier har en cellvägg som är tjockare än den grampositiva bakteriens vägg. Cellväggen består av: 

  • Ett membran. Innanför cellväggen. 
  • Teikoinsyra. Teikoinsyra finns bara hos den grampositiva bakterien, och kan se lite olika ut hos olika arter av grampositiva bakterier. Syran består i alla fall av polymerer (väldigt långa kedjor) av glycerolfosfat eller ribitolfosfat. Till dessa kopplas i sin tur olika former av socker, aminosocker och aminosyror. Teikoinsyran binds kovalent till N-acetylmuraminsyran i mukopeptiden, och kan dessutom vara bunden till bakteriens cellmembran genom olika fettsyror. Syran finns på bakteriens yta som en antigen. Dessutom kan man hitta mindre mängder av andra proteiner och polysackarider i de grampositiva bakterierna. Dessa kan skilja sig åt mellan de olika grampositiva bakterierna.

Den gramnegativa bakteriens cellvägg är tunnare än den grampositiva bakteriens. Den består av: 

  • Två membran. Ett innanför och ett utanför cellväggen. 
  • Lipopolysackarider. Ett protein som är giftigt för oss människor sitter längst ut, på den gramnegativca bakteriens yttre membran. 

Gramfärga bakterierna

När man gramfärgar bakterier duttar man en platinös i en CFU på agarplatta, sedan placerar man den på ett objektglas och droppar lite fysiologisk natriumklorid på den (en droppe). Om man har bakterierna i en buljong kan man röra om buljonen och droppa en droppe av den på ett objektglas. Det ska lufttorka. Sedan drar man objektglaset snabbt genom elded från an gasolbrännare. Då dör bakterierna, och det bränns fast i objektglaset så att de inte lossnar när man sedan färgar dem. 

När man använder man sig av två färger; kristallviolett och safranin. Den grampositiva bakterien färgas av båda färgerna, medan den gramnegativa bakterien bara färgas av den safraninet. Det beror på skillnaden i cellväggens uppbyggnad. 

Kristallviolett

Droppa kristallviolett på bakterierna. Färgen binder till bakterierna på runt en minut. 

Kranvatten

Vänd objektglaset upp- och ner så att strålen från kran inte spolar bort bakterierna. Spola bort den kristallblå färgen bara så att det inte är för mycket av det blå. 

Lugols lösning

Droppa lugols lösning på bakterierna. Efter en minut har den kristallblå färgen bundit inne i bakterierna, med hjälp av lugols lösning. 

Acetonsprit

Skölj preparatet med acetonsprit tills dess att det inte avfärgas längre. När det inte kommer nån er färg i diskhon är det klart. 

Fettet i den gramnegativa bakteriens cellväg är nu upplöst. Den tappar färgen helt. 

I den grampositiva bakteriens cellvägg finn mycket muren vilket inte löses upp av acetonspriten. Bakterien behåller sin kristallblå färg. 

Kranvatten

Vänd preparatet upp och ner igen. Spola försiktigt bort acetonspriten. 

Safranin

Droppa safranin över bakterierna. Efter en minut har färgen binit in och då blandas den röda safraninfärgen med den blå som finns i den grampositiva cellens vägg. Resultatet blir en blålila färg. Eftersom den gramnegativa cellen tappade all sin blå färg färgas den endast röd. 

Kranvatten

Vänd upp och ner på preparatet och skölj bort all safranin. 

Lufttorka och mikroskopera

Låt preparatet lufttorka (du ska inte skrapa bort cellerna med något papper). Sedan sätter du det i mikroskopet. Använd objektet med 100x i förstoring och en droppe immersionsolja. Ser du skillnaden på de grampositiva och de gramnegativa bakterierna? 

Vilket är sant och vilket är falskt?

  • Kocker är runda bakterier.
  • Lugols lösning färgar bakterierna blå.
  • Rödfärgade bakterier är gramnegativa.
  • Den grampositiva bakteriens cellvägg är tunnare än den gramnpositiva bakteriens cellvägg.
  • Lipopolysackarider finns på både grampositiva och gramnegativa bakterier.
  • När man färgar bakterier börjar man med kristallviolett.
  • Den grampositiva bakterien har bara ett membran.

Lagringsform

Bakteriernas morfologi

Den här bilden känner du igen! Att förstå att olika bakterier har olika form och att formen säger något om vilken typ av bakterie det är, det är viktigt. Att bakterier är uppbyggda på olika sätt, att de har olika form och struktur kallas med ett finare ord att de har olika morfologi. Formen på bakterien hjälper dig att ta reda vad det är för bakterie och hur man tar död på den. Den kunskapen har du nytta av senare, när du ska läsa om antibiotika och antibiotikaresistens. 

Lagringsform

Till vänster på bilden ser du stavar, i mitten kocker och till höger spiriller. Men förutom att de har olika form lagras de också på olika sätt. Vissa kocker ligger en och en, andra ligger två och två på objektglaset. Om de ligger två och två kallas de för diplokocker. Andra kocker ligger tillsammans som i en stor massa och då är det stafylokocker, medan streptokocker brukar ligga ett par stycken tillsammans i små rader. 

När stavar ligger tillsammans på streptokockers vis kallas det för att de ligger i kedjor. Ibland har stavarna dessutom en annan form, lite som ett riskorn. Då kallas de för fusiforma. 

Spiriller kan vara oböjliga eller böjliga, och då ser de lite olika ut under mikroskopet. 

Kombinationen av bakteriens form, tillsammans med gramfärgningen och lagringsformrn säger en hel del om vad det kan vara för bakterie du har hittat. Det är detta vi ska titta på i det här avsnittet.

Stafylokocker

Den här bilden visar kocker (bakterierna är runda). Kockerna är grampositiva (färgen är blålila). Kockerna ligger dessutom i stora grupp tillsammans, vilket betyder att detta är stafylokocker. 

Gissa bakterien

Vilken typ av bakterie är detta?

  • Grampositiv
  • Gramnegativ

Vilken typ av bakterie är detta?

  • Grampositiva
  • Gramnegativa

Vad är normalflora?

  • Bakterier som gör oss sjuka
  • Bakterier som finns ute i naturen
  • Bakterie som håller oss friska

Matcha påståendena med varandra

  • Lipopolysackarider
    Gramnegativ
  • Teikoinsyra
    Grampositiv
  • Mukopeptid
    Både grampositiva och gramnegativa bakterier
  • Lugols lösning
    Binder kristallviolett inne i bakterien
  • Acetonsprit
    Löser upp den gramnegativa bakteriens cellvägg